ELISA檢測試劑盒應用定性夾心免疫檢測技術
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ELISA檢測試劑盒應用定性夾心免疫檢測技術

出處:www.weikeqi-biotech.com   分類:公司新聞  發布:2020-2-20 13:51:47   閱讀:(911)

  ELISA檢測試劑盒應用定性夾心免疫檢測技術,用合成的HEV(Hepatitis E virus戊型肝炎病毒)多肽抗原包被微孔板板條,這些多肽是中國型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強的肽段,分別來自于該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標準品加入孔中并孵育,如果其中存在HEV IgM抗體,這些抗體就會與HEV 的多肽抗原結合,并固定在上面,洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP(辣根過氧化物酶)酶結合物,經第二次孵育后,酶結合物就會與次孵育結合上的HEV IgM抗體相結合,洗板除去未結合的酶結合物,加入TMB底物溶液,在第三次孵育時會發生酶-底物反應,只有那些含有HEV IgM抗體和酶結合物所形成的復合物的孔才會發生顏色變化,加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應,并在波長: 450nm處測量O.D.值,按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒的測試標準, O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認為是初試陽性。

  ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應的結果,使測定方法達到很高的敏感度。

  ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑:(1)固相的抗原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent);(2)酶標記的抗原或抗體,稱為“酶聯物”、“結合物”(conjugate);(3)酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,可設計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型:

  在臨床檢驗中,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步法檢測。

  雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色,測知標本中抗原的量?! ≡谂R床檢驗中,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步檢測。

  在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象,此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2,圖1-4),如按常法測讀,所得結果將低于實際的含量,這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect),因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時,反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應注意可測范圍的值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

  假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

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